style="width:3.25334in;height:0.66in" /> (1) 本文是学习GB-T 33309-2016 化妆品中维生素B6 吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛 5-磷酸酯 的测定 高效液相色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了化妆品中维生素
B,(吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯)的高
效液相色谱测定方法。
本标准适用于膏霜、乳液、液体类等化妆品中吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷
酸酯的测定。
本标准方法检出限为：吡哆醛1.0 mg/kg、 吡哆素0.3 mg/kg,
定量限为：吡哆醛2.5 mg/kg、 吡哆素
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
本标准通过酶解、皂化反应将样品中的维生素 B
均转化为吡哆素或吡哆醛的形式，利用高效液相
色谱配荧光检测器进行分离及分析，保留时间定性，外标法定量测定维生素B₈
的含量。
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682 规定的一级水。
4.3 碱性磷酸酶：酶活力不小于10 U/mg。
4.5 氨水：优级纯，含量为25%～28%。
4.7 磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ ·2H2O)。
4.10 氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250 g,加入200 mL 水溶解。
4.11 30%磷酸水溶液(体积分数):准确量取30 mL 磷酸(4.4)和70 mL
水，混匀后备用。
4.12 30%氨水溶液(体积分数):准确量取30 mL 氨水(4.5)和70 mL
水，混匀后备用。
GB/T 33309—2016
4.13 盐酸溶液(5.0 mol/L,0. 1 mol/L):量 取 4 0 mL 、0.8mL
盐酸(4.9)分别放入两个100 mL 容 量 瓶
中，用水定容，分别得5.0 mol/L、0.1 mol/L盐酸溶液。
4.14 氢氧化钠溶液(5.0 mol/L,0. 1 mol/L):称取20g 、0.4g
氢氧化钠用水溶解，分别放入两个100mL 容 量瓶中，用水定容，分别得5.0
mol/L、0.1 mol/L氢氧化钠溶液。
4.15 离子对试剂缓冲溶液[0.02 mol/L 磷酸二氢铵缓冲溶液(含0.001 mol/L
七氟丁酸)]:称取2.30g 磷 酸二氢铵，加入约980 mL
水溶解，用30%磷酸(4.11)或30%氨水(4.12)调节pH 值至4.5,加入170μL
七氟丁酸(4.2),用水定容至1 L 备用。
4.16 磷酸氢二钠溶液(0.1 mol/L): 称取17.8 g
磷酸氢二钠(4.7),用水溶解，定容至1000 mL, 用氢氧 化钠溶液(4.14)调节 pH
值至9.8,备用。
4.17 碱性磷酸酶溶液(1.0 g/L): 称取50 mg 碱性磷酸酶，用水定容至50 mL。
临用前配制。
4.18 标准样品：吡哆素和吡哆醛，纯度不小于99.0%。维生素 B₈
(吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸 酯和吡哆醛5-磷酸酯)的CAS
号、分子式、相对分子质量、化学结构式参见附录 A。
4.19 维生素 B,(吡哆素、吡哆醛)标准贮备液(1 mg/mL): 准确称取0.025
g(精确至0.0001 g)吡哆 素、吡哆醛标准品，分别置于25 mL
容量瓶中，用水溶解定容，配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，
于4℃避光保存，有效期3个月。
4.20 维生素 B;(吡哆素、吡哆醛)混合标准中间液1(100μg/mL)、
混合标准中间液2(10μg/mL): 分 别准确吸取维生素 B, 标准贮备液(4.19)5
mL、0.5mL 至 5 0 mL 容量瓶中，用水溶解、定容，混匀。
4.21 维生素 B。(吡哆素、吡哆醛)混合标准系列工作液：分别准确吸取维生素
B,混合标准中间液2(4.20) 0.1 mL、1.0mL,混合标准中间液1(4.20)1.0 mL、5.0
mL、10.0 mL、20.0mL至100 mL 容量瓶中，用水
溶解定容。该标准系列浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、5.0
μg/mL、10.0 μg/mL、 20.0μg/mL。 临用前配制。
4.22 微孔滤膜：0.45μm, 有机相。
5.1 高效液相色谱(HPLC) 仪：配有荧光检测器。
5.2 分析天平：感量为0.0001g 和0.01 g。
6.1.1 试样标签中标注含吡哆醛5-磷酸酯的试样
称取1.0 g 混合均匀试样(精确至0.0001 g)置于50 mL
具塞塑料离心管(5.6)中，加入1.0 mL 碱
性磷酸酶溶液(4.17)、用磷酸氢二钠溶液(4.16)定容至10.0 mL,
用涡旋混合器(5.3)充分混匀，置于水
浴振荡器(5.4)上，于(37±1)℃振荡酶解12 h 以上。
6.1.2 试样标签中标注含吡哆素、盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯的试样
称取1.0 g 混合均匀试样(精确至0.0001 g) 置于50 mL
具塞塑料离心管(5.6)中，加入10.0 mL
GB/T 33309—2016
水，用涡旋混合器(5.3)充分混匀。
于上述处理的试样溶液(6.1.1或6.1.2)中加入20.0 mL
乙醇，充分混匀后加入1.0 mL 氢氧化钾溶
液(4.10)混匀，置于水浴振荡器(5.4)上，于45℃±2℃避光振荡皂化45 min。
皂化完成后，取出冷却 至室温，加入1.05 mL
盐酸(4.9),用盐酸溶液(4.13)或氢氧化钠溶液(4.14)调节试样 pH 值至7.0,将试
样转移至50.0 mL 容量瓶中，用水定容至50.0 mL(V₁),
混匀，静置。准确移取5.0 mL(V₂) 上层清液
于25.0 mL 容量瓶中，用水定容至25.0 mL(V₃),
混匀，上清液过微孔滤膜(4.22)后，供 HPLC 测定。
高效液相色谱参考条件如下：
a) 色谱柱：C₈ 柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),5μm,或相当者。
b) 流动相：溶剂 A: 甲醇，溶剂 B:离子对试剂缓冲溶液(4.15)。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 检测波长：激发波长293 nm, 发射波长395 nm。
e) 柱温：35℃。
f) 进样量：10μL。
g) 梯度洗脱条件见表1。
表 1 液相色谱梯度洗脱条件
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系列标准工作液(4.21)按色谱条件(6.3.1)进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的溶液浓度
为横坐标作图，绘制标准工作曲线。吡哆醛、吡哆素标准样品色谱图参见附录B。
试样溶液(6.2)按色谱条件(6.3.1)进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，由色谱峰的峰面积
从标准曲线上求出相应的吡哆醛、吡哆素的浓度。样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性
范围内，超过线性范围的应稀释后再进样分析。
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
GB/T 33309—2016
试样中吡哆醛或吡哆素的含量按式(1)计算：
style="width:3.25334in;height:0.66in" /> (1)
式中：
X:—— 试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);
C; 从标准曲线上得到的待测液中维生素 B,
各组分的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
V₁— 样品提取液总体积，单位为毫升(mL);
V。— 稀释用样品体积，单位为毫升(mL);
V₃—— 稀释液体积，单位为毫升(mL);
m ——试样质量，单位为克(g)。
计算结果需扣除空白值，保留至小数点后一位。
注：试样中盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯以吡哆素计，吡哆醛5-磷酸酯以吡哆醛计。
吡哆素和吡哆醛分别在添加浓度1.2 mg/kg～20000 mg/kg 和2.5 mg/kg～20000
mg/kg 浓度范
围内，回收率在91.6%～108.1%之间，相对标准偏差小于10%。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
GB/T 33309—2016
(资料性附录)
吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯和吡哆醛5-磷酸酯的
CAS 号、分子式、相对分子质量和化学结构式
表 A.1
吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯和吡哆醛5-磷酸酯的
CAS 号、分子式、相对分子质量和化学结构式
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GB/T 33309—2016
表 A.1 ( 续)
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GB/T 33309—2016
(资料性附录)
吡哆醛、吡哆素标准样品色谱图
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保留时间t/min
说明：
2——吡哆素，tg=10.1 min。
图 B.1 吡哆醛、吡哆素混合标准样品色谱图
更多内容 可以 GB-T 33309-2016 化妆品中维生素B6 吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛 5-磷酸酯 的测定 高效液相色谱法. 进一步学习
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